如何实现CHO细胞瞬转不换液？

一、核心原理：绕过“换液”的必要条件

传统瞬转工艺（尤其是PEI法）通常建议在转染前进行换液操作，主要原因有二：

一是培养基中残留的血清、蛋白质或某些多价阴离子会干扰带正电的PEI与DNA复合物的形成及复合物与细胞表面的结合，降低转染效率；
二是转染后细胞代谢加速，营养需求陡增，若不换液，陈旧培养基中营养不足且代谢副产物（如乳酸、氨）浓度高，会抑制生长和表达。

高密度不换液工艺的原理，就是通过优化培养基配方、转染试剂性质以及操作时序，直接消除上述两个必须换液的前提条件：

1. 培养基的“转染兼容性”

使用无血清、化学成分限定、无动物源、且不含干扰转染复合物形成的高浓度多价阴离子（如高浓度硫酸根、磷酸根）的基础培养基。

诺佰佰生物的CHO瞬转产品

（https://novabioplus.cn/），其配方在设计时就考虑了与PEI类或新型阳离子聚合物转染试剂的兼容性，允许在高细胞密度（如8-12×10⁶cells/mL）下直接进行转染。

2. 转染试剂的高效性与低毒性

使用高效及低毒性的转染试剂。传统PEI（如线性PEI25kDa）转染效率较低，要达到理想效率需要较高的N/P比和用量，毒性较大。

诺佰佰新型阳离子聚合物

，转染效率较高，在不离心换液，DNA:转染试剂比例极低（1:1.5），及不孵育DNA与转染试剂的情况下仍可以实现80%的转染阳性率，且对细胞毒性较低，转染后细胞也能保持高活率和健康的代谢状态。

3. 营养“缓释”与代谢调控

不换液意味着要在一个封闭体系里支撑7-10天的蛋白表达。关键在于两点：

一是将易降解且有毒副作用的L-谷氨酰胺替换为长效谷氨酰胺二肽（如丙氨酰-谷氨酰胺），它能大幅减少氨的积累，维持稳定的pH和细胞活力；
二是通过使用瞬转专用补料培养基，在转染后24-48小时开始进行一次性或阶段性补料，精准补充关键氨基酸、能量底物（如葡萄糖）和关键因子，避免因营养耗尽导致的细胞凋亡。

二、具体实施策略

实现“不换液”的操作流程本质上是一种“立即转染”策略：

细胞培养阶段

使用优化后的高密度培养基将CHO细胞培养至目标的高密度（通常3-10×10⁶cells/mL），细胞活率需在95%以上。关键一步是不离心、不换液，直接将培养液作为转染基底液。

转染复合物制备与加入

采用“直接法”。将质粒DNA直接加入细胞培养物中，再加入适量缓冲液（如NovoCHO^TMBooster）和新型低毒转染试剂。高密度培养物的微环境、特定离子强度和pH值，恰好有利于DNA-转染试剂复合物在细胞表面原位高效形成并内吞。这彻底省去了“预孵育-换液-加复合物-再培养”的复杂步骤。

转染后补料

转染后第1天，以高浓度形式添加瞬转专用补料。这个时间点补入的营养物质足够支持后续约4-7天的蛋白合成，同时依靠长效谷氨酰胺二肽维持低氨环境。

三、为什么能实现高产量？

细胞密度基数优势

起始细胞密度是常规工艺的2-3倍。即使在瞬转后细胞分裂受抑，高基数也确保了更高浓度的活细胞总蛋白合成能力。

减少操作损伤

换液操作（离心或过滤）会造成机械损伤和细胞丢失。不换液直接转染，不仅节省时间，更保持了细胞的完整性和生理状态，减少应激反应。

产物质量更稳定

去除换液步骤，意味着产物的培养环境更稳定。特别是蛋白糖基化修饰对氨浓度和pH敏感，低氨环境有助于得到更均一的抗体N-糖谱，与大规模稳定细胞株的产物质量属性更接近。

总结与提醒