超快精准N端蛋白酶——质谱级rAsp-N

「 背景介绍 」

蛋白组学分析、翻译后修饰解析、单抗表征、蛋白及多肽药物质量研究中，蛋白酶酶切是质谱前处理的关键工序。酶切特异性、纯度和效率直接影响肽段质量；错切、杂酶污染、高背景噪音会带来质谱干扰，造成鉴定偏差，丢失关键位点与结构信息。常规胰蛋白酶仅识别赖氨酸、精氨酸，存在序列覆盖局限，难以满足药物申报级分析需求。质谱级 rAsp‑N 蛋白酶作为特色位点正交工具酶，可有效弥补胰酶短板，适配各类高精度要求质谱分析场景。

「 诺佰佰生物——rAsp-N蛋白酶 」

📕 产品信息

👍产品优势

✅超高纯度：

重组rAsp-N蛋白酶（质谱级），源自Pseudomonas fragi菌株重组表达，结合多步层析纯化工艺产品纯度超过97%，精准实现天冬氨酸、半胱氨酸N端特异性酶切，如果半胱氨酸还原或烷基化，仅-Asp-X 裂解。

✅蛋白酶切零干扰：

产品自带Tris-HCL与海藻糖稳定体系，重组表达无其他蛋白酶污染，不会产生质谱杂峰与背景噪音，从源头保障质谱检测、蛋白测序数据的真实性与准确性。

✅操作极简，省时高效：

超纯水即可彻底溶解，无需复杂预处理。超短2小时恒温酶切即可完成反应，对比传统过夜酶切方案，大幅缩短实验周期，适配高通量蛋白组学样本批量处理。

✅可与多种蛋白酶联合使用，提高蛋白序列覆盖率：

常规胰酶仅识别精氨酸、赖氨酸位点，存在大量蛋白序列盲区。rAsp-N靶向天冬氨酸、半胱氨酸N端独特位点，与胰酶酶切结果形成完美互补，大幅提升蛋白序列覆盖度，解锁更多未知结构域信息。

📊 数据展示

诺佰佰rAsp-N与某进口品牌rAsp-N酶切单抗样品TIC对比图：

图1. TIC图红色为诺佰佰，黑色为进口品牌

• 相比进口rAsp-N酶（蓝色箭头），诺佰佰rAsp-N酶错切产物极少；

• 诺佰佰正常酶切肽段（粉色箭头）丰度更高，证明酶切反应更充分、酶切特异性更好。

   

   

  相关产品列表

  序号	产品名称	货号
  1	Trypsin蛋白酶	PR2070
  2	rTrypsin   3.0蛋白酶	PR2071
  3	rTrypsin   5.0蛋白酶	PR2072
  4	rTrypsin/rLys-C复合蛋白酶	PR2073
  5	rLys-C蛋白酶	PR2074
  6	rTrypsin-N蛋白酶	PR2075
  7	rLys-N蛋白酶	PR2076
  8	rAsp-N蛋白酶	PR2077
  9	rGlu-C蛋白酶	PR2078
  10	α-Chymotrypsin蛋白酶	PR2079
  11	rIdeS蛋白酶	PR2080
  12	rIdeZ蛋白酶	PR2081
  13	O糖蛋白酶	PR2082

   

   

   

   

   

  其原理是利用SDS与蛋白结合形成恒定荷质比的复合物，在筛分介质中按分子大小分离，从而定量纯度、识别片段和聚集体。但问题在于：这个”标准答案”的前提假设是——所有蛋白都被SDS充分变性，形成均一的棒状SDS-蛋白复合物。而当这个前提不成立时，CE-SDS就可能”看到”不存在的峰。

   

   

  案例一：“mAb2困局”——CE-SDS报17%聚集体，SEC说只有0.5%

  2020年，Genentech在 《Analytical Biochemistry》上发表了一个令人警醒的案例。他们在分析三个IgG1单抗（trastuzumab、mAb1、mAb2）时发现：其中mAb2的非还原CE-SDS检测到约17%的高分子量（HMW）峰，但正交方法——体积排阻超高效液相色谱（SE-UHPLC）测得的天然聚集体只有约0.5%。两者的差异高达30倍以上。
  研究团队用差示扫描量热法（DSC）测定了SDS化学变性过程中的热力学参数，发现原因直指mAb2的高构象热稳定性：标准浓度的SDS和常规温度条件下，mAb2未被充分变性，形成了部分折叠的中间态物种，在CE-SDS中表现出了类似HMW的迁移行为。通过DSC数据指导SDS浓度和变性温度的优化，这个”假峰”才消失。

  这项研究说明一个简单的道理：CE-SDS测到的”聚集体”，可能只是”没变好性”。

   

   

  案例二：多特异性抗体假峰竟是”中途产物”

  2025年，在《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》 上报道了另一个经典案例 。
  他们在一款名为msAb-C的多特异性抗体的非还原CE-SDS分析中，发现主峰后出现了一簇意料之外的峰。这些峰的校正峰面积与上样浓度呈强依赖性——浓度越高，假峰越大——这本身就是一个危险信号。
  经过系统调查，这些假峰被证实为非共价（noncovalent）的人工聚集体，是电泳分离过程本身产生的，而非样品中原本存在的共价聚集体。
  该团队提出了三种消除方案：

  • 在样品或筛分胶缓冲液中添加更疏水的表面活性剂——十六烷基硫酸钠（SHS）。SHS的疏水性比SDS更强（C16 vs C12烷基链），能更有效地剥离蛋白间的非共价相互作用；

  • 降低样品上样量，减少电泳过程中的非特异性聚集概率；

  • 将毛细管分离温度提升至40°C以上，增强热变性效果。

  最终他们采用策略1+3，建立了准确可靠的纯度分析方法。

   

   

  案例三：“me-too”药物也有me-too的假峰

  2023年，在JPBA上报道了利妥昔单抗（rituximab）的”me-too”药物zuberitamab在还原CE-SDS中的假峰问题 。
  该团队在还原CE-SDS分析中发现zuberitamab的重链（HC）附近出现了一个非常规假峰。他们运用反相高效液相色谱（RP-HPLC）测定了整体疏水性，并通过软件模拟分析了局部疏水性和表面电荷。
  结论是：非共价蛋白聚集与局部氨基酸区域的高疏水性和低静电排斥力密切相关。换言之，某些抗体在特定区域的氨基酸序列天生”爱抱团”，在SDS未能完全覆盖这些疏水区域时，就形成了电泳中的假峰。

   

   

  案例四：帕妥珠单抗LC-LC二聚体，一场”12 kDa”的误会

  在2020年，在JPBA上报道了帕妥珠单抗（pertuzumab）及其生物类似药在还原CE-SDS中的LC与HC之间出现的一簇未知峰 。
  这些峰导致了（LC+HC）%纯度无法达标。常规方法优化——改变缓冲液pH、变性温度或孵育时间——都无效。
  团队通过反相液质联用（LC-MS）等多种技术手段，将这些峰定性为非共价形成的LC-LC二聚体。最终，通过将毛细管分离温度提升至60°C，同时将分离电压降低至9.5 kV这一不寻常的操作设置，成功消除了这些假峰。
  有趣的是，一个团队将毛细管温度提到了60°C，而另一个团队（2025年）指出40°C以上即可——不同抗体平台需要的变性程度确实不同，也侧面说明了方法开发需要”一药一议”。

   

   

   

  假峰从何而来？——共性机制的归纳

  梳理上述案例，CE-SDS假峰（人工非共价聚集体）形成的主要原因可以归纳为以下几点：

  原因	分子机制
  不完全变性	SDS浓度或温度不足，蛋白部分折叠
  疏水区域暴露	局部高疏水性导致分子间非共价结合
  静电屏蔽	低静电排斥力促进聚集
  浓度依赖	高上样量加剧非特异性相互作用
  序列特性	特定mAb/msAb的固有结构稳定性

  概括：当SDS没能把蛋白充分”剥开”，蛋白之间就会互相”拥抱”，在电泳中形成一个看起来很像杂质但实际并非共价连接的假峰。

   

   

  消除策略

  当怀疑出现非共价人工聚集体时，可按以下顺序尝试解决：

  • 方法一（低投入、易实施）：降低上样量- 提高毛细管分离温度至40-60°C- 优化SDS浓度

  • 方法二（更换试剂）：在样品或凝胶缓冲液中添加SHS替代部分SDS。Beckman团队早在2018年即证明CE-SHS法的分辨率提升3倍、塔板数提升8倍，且蛋白负载依赖性显著降低

  • 方法三（方法重新开发）：调整分离电压- 更换烷基化试剂（NEM替换IAM）

   

   

  诺佰佰生物针对双特异性抗体、抗体偶联药物（ADC）或膜蛋白等特殊样品类型的“CE-SDS峰形不佳”“疏水蛋白杂质无法准确定量”或“糖蛋白异构体分离困难”情况，开发出系列CE-SHS凝胶试剂，能有效的解决这些问题。如有需要请联系客服试用。

   

   

   

  产品试用申请 :

  诺佰佰市场部：021-5470 6068